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IP-MS常见问题（一）

news 来源：原创 2025/7/12 21:21:00

用于IP-MS实验的样品，需要多少样品量？

建议使用约2×107数量的细胞（约5 mg蛋白）进行IP实验。

其他类型的IP起始样品，如组织、细菌等可根据蛋白含量进行换算。

经过IP实验步骤或纯化富集的蛋白通常不超过10 μg，难以进行蛋白定量，因此IP-MS样品量通常以IP实验起始量作为衡量标准。

一定范围内，增大IP起始量可以提高IP-MS检测深度，获得更多的蛋白鉴定和定量结果，筛选获得更多可能的相互作用蛋白，尤其是相互作用较弱、未被之前研究发现的相互作用蛋白。

IP实验用量可根据抗体效价、诱饵蛋白表达丰度等因素调整。若诱饵蛋白表达丰度较高（例如采用过表达的标签蛋白作为诱饵蛋白），可适量降低细胞用量。若诱饵蛋白表达丰度较低、抗体亲和效价不理想，则需要提高细胞用量。

听说做IP-MS之前最好做预实验来降低失败风险，什么样的预实验结果可以表明IP实验成功，可以进行后续IP-MS的质谱检测和分析？

通常可认为IP-WB实验中诱饵蛋白在IP实验组泳道显色较深而在IP对照组泳道中无显色条带，可表明IP实验成功富集诱饵蛋白（具体参考《IP-WB的实验流程和结果解析》）。

但由于WB实验和质谱检测在原理和效果上的差异，以及当前商业化IP抗体的质量参差不齐，WB实验的结果并不能完全指示质谱检测分析结果。最终建议以一个IP实验组样品进行质谱检测以评估IP实验效果，诱饵蛋白质谱检测信号排名较高可说明IP实验成功（具体可参考《IP-MS蛋白互作组学解决方案》中IP效果评估产品）。

IP-MS实验中设置对照组可以提高互作蛋白筛选的命中率，那对照组应该怎么设置呢？

IP实验的对照组通常设置为空载标签表达细胞与相同标签抗体进行的IP，或以同种属空白对照IgG与相同细胞进行的IP。

IP-MS实验中的IP对照组为阴性对照，主要目的是为了在分析结果中过滤掉实验组鉴定到的非特异性结合蛋白。质谱仪检测灵敏度非常高，在实验组IP样品中，超过90%的蛋白鉴定结果可能都来自于非特异性结合蛋白或未清洗干净背景残留；但基于目前蛋白相互作用中大部分属于较弱的、瞬时相互作用这一认识，通常也不建议通过较剧烈的清洗方式排除非特异性结合蛋白。因此，科学地设置对照组是非常必要的。

IP实验对照组的设置需要遵循控制变量原则，即除了改变一个条件使对照组无法亲和纯化诱饵蛋白以外，其他所有实验条件、试剂种类以及用量需与实验组保持一致。

如果研究设计要比较不同条件下蛋白相互作用的变化，则建议在不同条件下分别设置对应的阴性IP对照组。

IP实验中各实验材料和溶液的用量？

每个IP样品各试剂材料用量建议如下：

细胞裂解液：1-2 mL

抗体：0.2-1 μg

Beads：30-50 μL（磁珠Beads）/50-100 μL（琼脂糖Beads）

注：

Beads用量为Beads与保存液充分混匀后悬浊液体积。

根据样品类型、起始细胞量和蛋白浓度的不同，细胞裂解液用量可进行相应调整。

根据抗体种类、效价和价格成本的不同，抗体用量可进行相应调整。

根据Beads品牌、种类和保存液比例的不同，Beads用量可进行相应调整，具体可参考Beads厂商提供的说明书。

自己做完IP实验后，应该用什么方式送去进行MS检测？

建议以PBS清洗后的Beads沉淀形式送样。

PBS清洗的主要目的是降低Beads样品中的非特异性结合背景蛋白，以及置换掉上一步与Beads一同孵育的细胞裂解液中的去垢剂（如NP40、TritonX-100等）。此步骤也可以使用其他不含去垢剂的清洗液进行Beads的清洗。

清洗后需要去除上清，Beads以沉淀形式进行保存和寄送。如需进行样品分装以完成其他实验，可在最后一次清洗去除上清前进行Beads悬液的分装。

IP-MS的实验流程和实验步骤？

IP-MS的完整流程通常包括：

①细胞裂解

②细胞裂解液、抗体、Beads孵育

③Beads清洗

④蛋白洗脱

⑤蛋白酶解和脱盐

⑥质谱检测

⑦数据分析

其中①-③步需由客户自行完成，实验步骤可参考《谱度众合 IP-MS 实验步骤》

样品可在第③步完成后寄送。WB等预实验可在第③步后分装样品进行。

IP-MS常见问题（一）

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