当前位置：首页 > news >正文

穿心莲内酯（andrographolide）生物合成CYP72-文献精读106

news 来源：原创 2025/5/17 9:20:53

Two CYP72 enzymes function as Ent-labdane hydroxylases in the biosynthesis of andrographolide in Andrographis paniculata

两种CYP72酶在穿心莲（Andrographis paniculata）中作为Ent-labdane羟化酶，在穿心莲内酯（andrographolide）的生物合成中发挥作用

穿心莲（Andrographis paniculata）（Burm.f.）Wall. Ex Nees，隶属于爵床科（Acanthaceae），是一种广泛栽培的年生药用植物，主要用于东南亚和南亚的多种药用用途。其全提取物及单体成分具有广泛的药理作用，包括抗炎、抗微生物、护肝和抗癌作用（Subramanian等，2012）。许多具有生物活性的次级代谢产物已从穿心莲的叶和根中分离出来，其中穿心莲内酯（andrographolide）是一种Ent-labdane二萜类化合物，被认为是主要的生物活性成分（Subramanian等，2012）。例如，传统中药注射液Xiyanping®，由穿心莲内酯磺酸盐制成，广泛用于治疗中国的上呼吸道感染、病毒性肺炎和支气管炎。由于其药用特性，穿心莲内酯的生物合成受到了广泛的研究，基因组数据和萜烯合酶的功能也已被报道（Sun等，2019）。然而，负责其生物合成途径中关键药理活性基团结构修饰的酶仍然未知。

穿心莲内酯的生物合成中的修饰步骤包括C3、C14、C18位的羟基化以及C15–C16位的内酯环形成。这一系列的氧化过程被认为是由细胞色素P450酶（CYP450s）介导的。为了准确筛选出参与穿心莲内酯生物合成途径的CYP450s，我们构建了穿心莲幼苗的差异生物累积样本（图S1）。在100 μM甲基 Jasmonate（MeJA）处理后，穿心莲内酯的产量在接种后24小时（hpi）显著增加，并在72 hpi时达到了37.8 mg/g DW，比对照组高约10倍（图1a）。随后，我们构建了基因表达图谱，并研究了穿心莲中基因表达的时序变化。与0 hpi时收集的样本相比，12 hpi、24 hpi和48 hpi时的样本表达谱表现出显著不同的模式（图S2）。通过设定FPKM的四倍差异阈值和假发现率小于0.05，我们鉴定出在12 hpi、24 hpi或48 hpi时有4463个基因的表达水平上调，相较于对照组样本（图1b）。

(a) 穿心莲内酯在MeJA处理下的积累逐渐增加。 (b) 与对照组相比，MeJA处理下不同诱导时间点上调基因的Venn图。 (c) 参与萜烯类生物合成的基因表达模式。 (d) MeJA处理后15个CYP基因在各时间点的倍数变化柱状图。 (e) CYP72F1催化14-deoxyandrographolide酶反应的UPLC-qTOF-MS结果。 (f) 候选P450基因和萜烯合酶基因在染色体上的定位。 (g) CYP72A399催化andrograpanin酶反应的UPLC-qTOF-MS结果。 (h) 两个CYP72家族P450酶催化穿心莲内酯的生物合成途径。 (i) 与Salvia miltiorrhiza、Scutellaria baicalensis和Leonurus japonicus的候选和功能性P450基因的微共线性分析。 (j) CYP72家族候选和功能性P450酶的最大似然树。误差条表示标准偏差SD（n = 3个生物学独立样本；每个比较使用Student’s t检验；, **, **或****表示P值<0.05, <0.01, <0.001或<0.0001）。

作为萜烯合成的上游途径，MeJA处理显著诱导了美克酸（MVA）和甲基红宝石磷酸（MEP）途径中的所有基因的表达。大多数基因在12小时或48小时诱导后达到了表达的最高水平。正如预期，GPP合酶（GPPS）、FPP合酶（FPPS）和GGDP合酶（GGPPS）的表达显著增加，并保持在相对较高的水平，ApCPS2的表达显著提高，比对照样本高出约30倍（图1c）。转录组数据揭示，共有154个CYP450基因在诱导过程中至少在一个时期内显著增加或减少，其中96个来源于CYP71家族（图S3a,b），目前发现的许多二萜类生物合成的P450酶属于该家族（Zheng等，2019）。在154个CYP450基因中，54个基因在所有诱导时间点的表达都有增加，其中32个属于CYP71家族（图S3c）。根据诱导后表达的逐渐增加，选择了10个CYP71家族基因、4个CYP72家族基因和1个CYP85基因作为候选基因（图1d）。

通过共表达筛选鉴定的候选P450基因在酵母中表达，并随后提取其微体（图1d）。通过与六种预期为穿心莲内酯生物合成途径中的中间体的穿心莲内酯化合物进行酶促反应，验证了CYP450酶的催化功能（图S4）。通过分析酶促反应产物并与标准品比较，发现TR79615催化了14-deoxyandrographolide（2）作为底物生成穿心莲内酯（1）（图1e）。根据系统命名法，TR79615被命名为CYP72F1。产物结构显示，CYP72F1能够促进14-deoxyandrographolide的C14位羟基化，同时将双键重排到C12和C13位（图1h和S5a）。并且生成了两个与穿心莲内酯分子量相同的副产物（图1e和S5b,c），推测为具有不同双键位置的穿心莲内酯异构体。植物CYP450酶能够催化具有相同骨架结构的多个底物（Ma等，2021）。还发现CYP72F1微体也与andrograpanin反应，考虑到植物CYP450酶针对底物氧化位点的特异性以及底物和产物之间的极性差异，我们假设CYP72F1可以催化andrograpanin的C14羟基化和C12与C13双键重排，生成3-deoxyandrographolide（图S6）。

随着基因组数据的不断发展，越来越多参与植物二萜类生物合成途径的关键基因已被证明聚集在基因组中（Ma等，2021）。基于A. paniculata的已报道基因组数据（Sun等，2019），我们对图1d中的CYP72F1和其他候选基因进行了基因组定位研究。结果显示，七个CYP450基因属于CYP72家族，并且与CYP72F1位于2号染色体上，且这些基因之间的距离较小（图1f）。研究了这些CYP450基因在MeJA诱导后的表达趋势（图S7），发现TR81244的表达在24小时诱导后显著上调，然后下调，这与MVA途径基因和GGPPS的表达模式相似（图1c）。随后，克隆并在酵母中表达了这四个CYP72基因，使用穿心莲内酯化合物作为底物进行酶促反应。结果显示，TR81244能够催化andrograpanin（3）生成新的产物峰，并且通过与标准品比较，确认产物为14-deoxyandrographolide（2）（图1g和S8a）。因此，TR81244被命名为CYP72A399，并确认了其催化活性，促进了andrograpanin的C3位羟基化（图1h）。CYP72A399还能够催化ent-cppalol和16,19-dihydroxy-ent-copalol作为底物，根据CYP450催化位点的特异性，我们推测它也催化它们的C3位生成羟基化产物（图S8b–f）。

对这些来自2号染色体的CYP72基因进行了染色体定位和共线性分析，并与富含二萜类的物种如Salvia miltiorrhiza、Scutellaria baicalensis和Leonurus japonicus进行了比较。这些共线性基因也聚集在其他物种的相同染色体或基因组框架上（图1i），为进一步探索萜烯类生物合成途径基因的聚集提供了参考。由于L. japonicus中富含ent-labdane萜类化合物（Wang等，2022），我们通过共线性分析获得的三种L. japonicus CYP450基因在酵母中表达，验证它们是否具有类似功能。发现Lej2023具有与CYP72A399相同的催化功能，催化andrograpanin C3位羟基化生成14-deoxyandrographolide（图S9）。

在植物中，CYP72家族是参与次级代谢的最大CYP450家族之一，但关于CYP72家族基因的生化信息尚有限。目前鉴定的CYP72家族蛋白能够促进吉贝素（He等，2019）、三萜类（Biazzi等，2015）和西洛加酸（Yang等，2019）等途径中的氧化等复杂生物催化过程。本研究中鉴定的两种CYP72蛋白拓展了我们对CYP72家族相关新型催化功能的理解（图1j）。这些CYP72蛋白被分类为两个亚家族，且在穿心莲的染色体上聚集，持续催化穿心莲内酯生物合成途径中的最终步骤。涉及C14羟基化和C3氧化的催化过程对于穿心莲内酯衍生物的形成至关重要，这对增强穿心莲内酯的抗肿瘤活性具有重要作用（Zhang等，2021）。

总之，本研究通过萜烯途径共表达和基因簇分析报告了穿心莲中CYP72家族的两个CYP450基因，这两种CYP72 CYP450酶催化了C3和C14羟基化以及C12–C13双键重排，这些是穿心莲内酯生物合成途径中的关键步骤。

Two CYP72 enzymes function as Ent-labdane hydroxylases in the biosynthesis of andrographolide in Andrographis paniculata

相关文章：