Genome Research | 俄亥俄州立于忠堂组-结合深度学习与蛋白质数据库系统探究反刍动物真核微生物...

结合深度学习与蛋白质数据库系统探究反刍动物真核微生物

Probing the eukaryotic microbes of ruminants with a deep-learning classifier and comprehensive protein databases

期刊：Genome Research

DOI：https://doi.org/10.1101/gr.279825.124

第一作者：Ming Yan （严鸣)

通讯作者：Zhongtang Yu （于忠堂）

主要单位：

美国俄亥俄州立大学动物科学学院 （Department of Animal Sciences, The Ohio State University, Columbus, OH, USA)

美国俄亥俄州立大学微生物组研究中心 （Center of Microbiome Science, The Ohio State University, Columbus, OH, USA)

挪威生命科学大学 （Norwegian University of Life Sciences）

昆士兰科技大学 （Queensland University of Technology）

美国俄亥俄州立大学动物科学学院以及微生物组研究中心的Zhongtang Yu教授团队于近日在老牌生物信息/基因组学top期刊Genome Research上发表，题为Probing the eukaryotic microbes of ruminants with a deep-learning classifier and comprehensive protein databases (https://genome.cshlp.org/content/early/2024/12/24/gr.279825.124.abstract) 的研究成果。

- 摘  要 -

宏基因组学，特别是以基因组为核心的宏基因组学，显著加深了我们对微生物的理解，揭示了它们的分类和功能多样性以及在生态学、生理学和进化中的作用。然而，由于缺乏全面的参考基因组数据库和强大的生物信息学工具，各种微生物群（包括哺乳动物胃肠道微生物群）中的真核生物种群在宏基因组学研究中相对较少被探索。反刍动物的胃肠道，特别是瘤胃，尽管纤毛虫和真菌的多样性相对较低，却含有较高的真核生物生物量。这些真核生物对饲料消化、甲烷排放和瘤胃微生物生态学具有显著影响。在本研究中，我们开发了GutEuk，以识别宏基因组中的真核生物序列，相较于此前开发的Tiara和EukRep，在准确度方面有了显著提升。GutEuk针对不同长度的序列进行了高精度优化，还能区分真菌和原虫序列，从而进一步揭示它们在生态学、生理学和营养学中的独特影响。GutEuk在分析超过一千个瘤胃宏基因组时表现出色，揭示了原生动物比以往文献中记录的具有更大的基因组多样性。此外，我们还整理了多个反刍动物真核生物蛋白质数据库，大大提高了区分反刍动物真菌和原生动物与原核生物功能角色的能力。总体而言，新开发的GutEuk工具包及其相关数据库为深入研究胃肠道真核生物提供了新的机会。

- 引  言 -

瘤胃独特的复杂多界微生物生态系统通过消化和发酵植物材料，为反刍动物提供高达70%的能量需求。然而，这一过程也导致甲烷排放，反刍动物排放的温室气体占人为温室气体排放的约14%。瘤胃微生物还将饮食中的氮，包括蛋白质和非蛋白氮，转化为高质量的微生物蛋白。微生物蛋白占小肠可代谢蛋白质的80%。瘤胃微生物群主要与反刍动物的营养和生产相关，而下消化道微生物群则更多地与动物健康和宿主生理有关。这种复杂且相互依赖的多界生态系统包括厌氧细菌、古菌、真菌、原生动物和病毒，各自占据独特的生态位。尽管瘤胃和肠道的原核生物群落已通过多组学技术得到广泛研究，但对真核生物群落的分析仍主要依赖针对原生动物18S rRNA基因和真菌的内部转录间隔区（ITS）的扩增子分析，这些方法在分类分辨率和功能信息上具有局限性。且瘤胃原生动物和真菌缺乏综合的基因组数据库进一步限制了这些真核生物的组学分析。因此我们对瘤胃内真核生物群落功能重要性的理解，仍主要基于少量物种的培养和基因组研究。

与人类肠道中真核生物占微生物群不足1%不同，瘤胃微生物群中真菌和原生动物的生物量分别可占20%和50%。瘤胃真菌是专门分解纤维的微生物，能够产生多种碳水化合物活性酶（CAZymes），尤其是那些能水解难降解植物细胞壁材料的酶，以补充了瘤胃细菌的CAZymes。此外，肠道真菌还能产生多种具有潜在抗菌和治疗特性的次级代谢产物。然而除了从瘤胃分离出的Pecoramyces sp. F1，所有可用的反刍动物肠道真菌基因组（包括Anaeromyces robustus、Caecomyces churrovis、Neocallimastix californiae、Neocallimastix lanati和Pecoramyces ruminantium）均来自粪便样本，因此也代表后肠真菌。尽管瘤胃和后肠共享一些真菌，但它们具有不同的真菌群落，目前尚不清楚瘤胃和后肠的真菌酶库是否存在差异。虽然真菌对瘤胃纤维降解的贡献得到了充分认可，但瘤胃原生动物的功能复杂多样，既包括纤维降解和瘤胃pH值稳定等生产性作用，也包括促进甲烷排放和浪费性瘤胃内微生物蛋白回收等不利作用。事实上，瘤胃原生动物与甲烷排放呈线性关系。由于其与饲料效率和甲烷排放的负面关联，一些研究试图特异性抑制优势种Entodinium。另一方面，对单细胞扩增基因组（SAGs）和随后进行的瘤胃原生动物蛋白质组学分析揭示了意想不到的多样化CAZymes库。此外，最近的研究表明，瘤胃原生动物与饲料效率之间存在关联，而肠道原生动物与犊牛肠道健康之间也存在联系。因此，除了针对瘤胃原生动物的扩增子分析，全面分析反刍动物胃肠道中真核生物的基因组和基因表达至关重要。此外，建立综合的蛋白质数据库，对实现对关键瘤胃功能和动物生产中原生动物基因/蛋白质表达的全面分析至关重要。

单细胞基因组学已被证明在揭示原生动物基本生物学特性方面具有价值，但在原生动物群落的生态研究中成本效益不高。宏基因组学在研究各种微生物群（包括反刍动物胃肠道微生物群）方面实现了革命性进展，但大多数研究集中在细菌和古菌上，而忽略了真菌和原生动物。目前有两种基于机器学习的工具（Tiara和EukRep）可用于直接从宏基因组装配中识别真核生物序列。基于这些工具的研究表明，原生动物在水生环境中具有重要的生态作用。然而，尚不清楚上述工具是否可用于分析瘤胃等宿主相关生态系统中丰富的真核生物。此外，反刍动物胃肠道（特别是较少研究的后肠和反刍动物物种）的多样性和功能库仍然有限。因此，我们的第一个目标是对现有工具进行基准测试，用于分类反刍动物肠道真核生物，并开发一种新工具（称为GutEuk）以识别和分类源自反刍动物肠道宏基因组中的真核微生物（真菌和原生动物）。通过GutEuk，我们还旨在重新分析超过一千个反刍动物胃肠道宏基因组和宏转录组，并为反刍动物肠道真核生物创建蛋白质数据库。这些分析包括前肠（主要为瘤胃，也包括网胃、瓣胃和皱胃）和后肠（盲肠、结肠和直肠）的样本，涵盖各种反刍动物物种（包括家养物种，如Bos taurus和Ovis aries，以及野生物种，如Capreolus capreolus和Hydropotes inermis）。我们的最后一个目标是利用最新产生的宏蛋白组数据，对新建立的蛋白质数据库进行基准测试。总体而言，GutEuk及其创建的新蛋白质数据库为分析宿主相关微生物群中的真核微生物（尤其是瘤胃中的微生物）提供了新的机会。

- 主要发现 -

① 新开发的GutEuk工具改进了

从宏基因组中识别真核微生物的能力

我们在contig水平上使用独立数据集对GutEuk与EukRep和Tiara的性能进行了基准测试。GutEuk在不同长度的contig上均显著优于Tiara和EukRep（图2A）。GutEuk与Tiara在识别真核contig方面表现出相当的精确性，而EukRep的精确性略低，特别是在长度低于20kb的contig中。然而，对于原核contig，GutEuk即使在长度低于15kb时仍保持了约99%的精确性，而Tiara和EukRep在长度低于10kb的contig上分别仅达到95%和91%的精确性。在长度为3到5kb的contig上，Tiara和EukRep的性能明显逊于GutEuk。在召回率方面，对于原核contig，三种工具的表现相似。但对于真核contig，GutEuk在长度低于15kb时的召回率接近99%，在更长的contig上仍保持约98%。相比之下，EukRep的最高召回率为95%，在长度低于10kb时下降到90%以下，而Tiara在长度为5到10kb的contig上最高仅达到82%，在更长的contig上表现更差。在计算时间方面，GutEuk在使用20线程的情况下，用9.3小时处理了包含965,741个序列（总计4.6 Gb）的测试数据集。相比之下，Tiara和EukRep在相同资源下分别用时0.3小时和2小时完成了相同任务。我们还评估了GutEuk进一步区分原生动物和真菌contig的能力（图2B）。对于长度低于15kb的contig，由于最多可分类的片段数为2，阈值的选择不会影响其性能（两片段的预测结果必须一致）。对于超过15kb的contig，随着置信水平（pt2）的提高，精确性如预期增加，而召回率下降。在pt2为0.5时，精确性超过90%，在pt2高于0.8时达到95%。在召回率方面，GutEuk在pt2为0.8时对原生动物和真菌的召回率分别超过70%和85%。因此，研究者可根据具体研究目标调整pt2，以优化GutEuk的精确性和召回率。然而，在pt2为0.8时，精确性超过95%，被认为是较为保守的选择。

Fig. 2: Benchmarking the performance of GutEuk, EukRep, and Tiara for contigs.

在评估GutEuk识别微生物真核contig性能的基础上，我们进一步测试了它在多样的基因组中（包括数据库中收录的水生真菌和原生动物）是否能够实现一致的分类结果（Fig. 3）。GutEuk利用扩展的训练集和更复杂的模型，在对大多数真核微生物DNA分类方面表现出色，尤其是在分类代表性不足的瘤胃纤毛虫原生动物方面。对于GutEuk唯一一个分类准确率低于70%（约为45%）的真核基因组是淡水原生动物 Stentor coeruleus（GCA_001970955.1）。相比之下，Tiara和EukRep各有14个真核基因组的分类准确率低于70%。这些结果表明，在pt1为0.5的情况下，GutEuk在预测真核微生物基因组/基因组bin方面的准确性优于Tiara和EukRep。更重要的是，GutEuk还能以较高的准确性进一步将真核基因组分类为真菌或原生动物，除了少数不属于哺乳动物胃肠道的真菌和原生动物基因组。例如，GutEuk对以下真菌基因组的分类准确率低于50%：Smittium mucronatum（GCA_001953115.1，昆虫肠道共生菌）、Vavraia culicis（GCA_000192795.1，微孢子虫寄生虫）和Enterospora canceri（GCA_002087915.1，感染蚊子和欧洲岸蟹）。同样，分类准确率低于50%的原生动物基因组也不属于胃肠道，包括寄生双鞭毛虫 Perkinsus marinus（GCA_000006405.1）和 Perkinsus sp. BL_2016（GCA_004369235.1），以及水生纤毛虫 Stentor coeruleus（GCA_001970955.1）和 Lenisia limosa（GCA_001655205.1）。鉴于肠道真核生物的系统发育范围较窄，GutEuk预计在肠道宏基因组序列中表现良好。若需更低的假阳性率，可使用更高的pt2阈值（如0.8）。此外，GutEuk对新测序的人类肠道真菌基因组的识别率也极高，成功将708个基因组中的697个（98.4%）正确分类为真菌。

Fig. 3: Benchmarking the performance of GutEuk, EukRep, and Tiara with genomic bins.

② 从代表性不足的反刍动物物种中

鉴定出多样的瘤胃原生动物

截至目前，共有53个瘤胃纤毛虫基因组，包括52个单细胞扩增基因组（SAGs）和一个单一物种基因组。这些基因组代表了19种在各种反刍动物物种中常见的瘤胃纤毛虫。我们使用GutEuk系统分析了从1,093个先前测序的瘤胃宏基因组中组装的15,000个bin（每个bin超过3 MB），以识别真核生物bin。这些样本来自13种不同的反刍动物，包括家养和野生物种，具有不同的摄食习惯。我们鉴定出了数百个原生动物bin和一个真菌bin。鉴定出的真菌bin稀少可能反映了其低丰度以及瘤胃液样本中真菌DNA产量较低的原因，因为瘤胃真菌通常牢固附着于消化物颗粒上。

我们根据谱系特异的单拷贝标志基因的存在评估了鉴定出的真核生物bin的基因组完整性，发现大多数bin的完整性较低，这与最近一项使用EukRep进行真核bin鉴定的研究结果一致。尽管从瘤胃宏基因组中鉴定的大多数真核生物bin不完整，但我们仍发现了21个完整性超过50%且污染率低于10%的原生动物bin。我们进一步对这组原生动物bin及瘤胃原生动物SAGs进行了系统发育分析（Fig. 4）。从30个连接的单拷贝标志蛋白构建的系统发育树显示，新发现的瘤胃原生动物bin与SAGs在Vestibuliferida目内聚集。相比之下，所有Entodiniomorphida目SAGs形成一个独立的聚类，这表明Vestibuliferida物种可能存在更大的未被发现的多样性。

值得注意的是，使用30个单拷贝标志蛋白构建的系统发育树的拓扑结构与基于113个单拷贝标志蛋白的SAGs原始系统发育树一致。这种一致性表明了我们系统发育分析的稳健性。此外，一些新鉴定的原生动物bin来源于此前未进行过原生动物基因组测序的反刍动物物种的宏基因组中，例如Bison bison和Bos indicus。因此，未来的原生动物研究应扩大至研究更多的反刍动物物种，以达成瘤胃真核生物的全面分析。

Fig. 4: A phylogenomic tree of the identified rumen protozoal bins and 49 rumen protozoa single-cells assembled genomes.

③ 反刍动物肠道真核生物的

蛋白质数据库及其编码糖苷水解酶和肽酶的基因库

从各种反刍动物的肠道宏基因组中识别的真核生物序列，我们预测并翻译了它们的蛋白质序列，随后构建了多个蛋白质数据库。这些肠道真核微生物蛋白质数据库包括一个前胃原虫（包括新识别的和来自52个单细胞基因组（SAGs）的序列、前胃真菌和后胃真核生物的数据库。前胃原虫数据库包含了25,498,129个蛋白质，这些蛋白质按50%氨基酸同一性聚类为5,265,119个蛋白质簇，其中54%为新识别的。在这些簇中，只有10%被注释。前胃真菌数据库则小得多，包含11,314个蛋白质，形成了7,293个蛋白质簇。大约一半的真菌蛋白质簇可以注释。值得注意的是，后胃真核生物蛋白质簇的注释比例超过了92%。相比之下，前胃原虫蛋白质的注释比例较低，这突显了进一步研究瘤胃原虫的必要性。其原因也体现在其复杂的功能和影响上，例如对其他瘤胃微生物的捕食、植物材料的酶解降解以及与细菌和古菌的共生相互作用。

过去，细菌和真菌被认为是瘤胃微生物群中大部分纤维素降解活性的来源。然而，近期的基因组学研究和代谢蛋白质组学研究揭示了瘤胃原虫中含有大量编码糖苷水解酶的基因，包括纤维素酶和半纤维素酶。在本研究中，我们对前胃原虫数据库进行了GHs的注释。我们发现，淀粉酶（例如GH13）和纤维素酶（例如GH5和GH9）是最常见的CAZymes，突显了瘤胃原虫具有重要的纤维降解和淀粉降解能力（Fig. 5B）。

瘤胃原虫已知能够降解蛋白质，尤其是微生物蛋白质。因此，我们还对前胃原虫数据库进行了肽酶的注释。在识别到的肽酶中，金属酶、天冬氨酸酶、半胱氨酸酶和丝氨酸酶占主导地位，其中M08、C01、A01和S09肽酶是最常见的分泌型肽酶（Fig. 5C）。Prevotella是瘤胃中最主要的细菌属，具有广泛的蛋白酶活性，其具有48种不同的分泌型肽酶家族。相比之下，从瘤胃原虫蛋白质中识别到58种不同的分泌型肽酶家族（Fig. 5D），突显了它们巨大的蛋白水解潜力。此外，瘤胃原虫中氢化铁蛋白还原酶的识别也证实了它们产生氢气的能力。

Fig. 5: Diverse ruminant gut eukaryotic proteins identified in the databases.

④ 反刍动物肠道真核生物蛋白质数据库

提高了蛋白质组学中的蛋白质识别

最近，一项代谢蛋白质组学研究展示了使用单细胞基因组（SAGs）和基因组作为参考搜索数据库来注释瘤胃原虫蛋白质组，并评估瘤胃真核生物在瘤胃功能中的重要性。鉴于参考搜索数据库是复杂微生物组代谢蛋白质组学研究中的主要瓶颈，并且考虑到瘤胃真核生物已被证明具有高度的基因组和功能多样性，我们评估了通过将反刍动物真核蛋白（通过GutEuk识别的）扩展到原虫基因组数据库中的潜力，以增强从瘤胃代谢蛋白质组学数据中检测蛋白质的能力。使用与原始研究相同的流程和阈值，我们比较了使用以下两种数据库在每个样本中识别的蛋白质组数：（i）原始基因组数据库（由一个Entodinium caudatum基因组和18个瘤胃原虫的SAGs组成）和（ii）一个扩展的数据库，该数据库将原始基因组数据库与通过GutEuk识别的瘤胃真核蛋白结合在一起。扩展的数据库使得在牛和山羊的瘤胃样本中能够识别更多的变形虫蛋白质组，牛样本平均增加了64%，山羊样本增加了20%（Fig. 6）。在某些样本中，原虫蛋白质组的增加约为200%，这表明某些样本中可能存在以前未识别的原虫。类似地，扩展的数据库大大增加了识别到的真菌蛋白质的数量，牛样本增加了118%，山羊样本增加了70%。值得注意的是，在原始研究中，平均仅识别到10个真菌蛋白质组。还需要指出的是，本次代谢蛋白质组学研究中的瘤胃样本是通过食道管收集的，这种方法主要收集瘤胃液，并显著降低了真菌生物量。

Fig. 6: Increases in the number of rumen protozoal and fungal protein groups identified with the new protein databases compared with the previous rumen proteomic study.

- 总结与讨论 -

从历史上看，肠道真核生物主要从寄生生物的角度进行研究。然而，真核生物群体也是肠道微生物群的重要组成部分，它们对整体微生物群落、宿主营养和生理起着重要作用。在瘤胃中，它们的作用尤为重要，瘤胃是反刍动物的前胃，其中真核微生物可以占到微生物生物量的50%，这一比例远高于其他生态系统。这些微生物在瘤胃发酵和纤维降解中起着直接作用，并直接影响宿主的几个重要特征，包括饲料效率和甲烷排放。尽管近年来在培养和基因组测序瘤胃原虫和真菌方面取得了一些进展，这一过程耗时耗力，且我们仍然缺乏一个生物信息学工具来分析从瘤胃样本宏基因组中的真核微生物。因此，开发专门针对肠道真核微生物，尤其是瘤胃中微生物的生物信息学工具，对于更全面地分析其基因组和蛋白质组至关重要。这些新工具将使我们从分类学分析转向功能分析，从而更深入地理解肠道真核微生物及整个肠道微生物群。

目前Tiara和EukRep已被用于真核序列识别，但它们未能准确识别瘤胃真核生物。为了促进肠道真核微生物，特别是瘤胃中微生物的宏基因组和功能分析，我们开发了GutEuk。与Tiara和EukRep相比，GutEuk在识别微生物真核基因组片段时具有更高的精确度和召回率。GutEuk中实现的集成模型，结合了CNN和FNN，能够在处理短序列（小于5 kb）和长序列（大于50 kb）时保持一致的性能。GutEuk能够进一步区分真菌和原虫序列，这对于分析包含两种真核微生物的微生物群落，如瘤胃微生物群，尤其有价值。尽管GutEuk是为肠道生态系统的宏基因组设计的，但它在跨越不同分类谱系的基因组时也表现出一致的性能，能够准确地区分真菌和原虫与其他生态系统中的基因组。由于肠道中的真核群落比水生和陆地环境中的真核群落多样性较低，且这些生态系统中的真核微生物多样性几乎没有重叠，因此GutEuk也适用于肠道宏基因组研究，正如其在新近测序的人类肠道真菌基因组中的应用所示。除了原核生物和真核生物外，宏基因组还可能包含大量的可移动遗传元件，如质粒和病毒。如果这些对元件有特别的兴趣，我们建议使用像geNomad这样的专用工具来过滤输入序列。

使用GutEuk，我们筛选了从瘤胃组装的成千上万个宏基因组bin，并识别了数百个单独的真核bin。通过对几十个至少中等质量的原虫bin进行系统发育分析，我们展示了瘤胃原虫的巨大基因组多样性，特别是在较少研究的反刍动物物种中。回收的高质量真核bin相对稀缺，可能归因于多种因素，包括瘤胃中真核生物的低丰度、它们庞大而复杂的基因组、高遗传异质性以及高度重复的基因组序列的存在。此外，由于存在可移动元件和同源基因，也存在形成嵌合bin的风险。因此，真核bin的注释应该谨慎进行。将contig分配到来自宏基因组序列的高质量MAGs中，尤其是短序列读取，可能具有挑战性。连续测序重复区域，以及长读取测序（如PacBio HiFi和Oxford Nanopore测序），可能有助于从宏基因组中组装和分配真核序列，特别是对于具有高度碎片化小染色体的原虫，如Entodinium属。随着单细胞测序的不断发展，GutEuk可以应用于在组装前筛选出共生原核生物序列，利用其在区分原核和真核序列方面的高准确性，提升基因组质量。此外，最近开发的bin refinement工具ACR可以进一步优化真核生物的基因组分析。此外，与对原核生物基因组和MAGs的评估类似，真核bin的完整性和污染率基于线粒体特异性标记基因的存在及相应数据库来确定。然而，这两个工具在应用于具有稀缺参考基因组的真核谱系时表现有限。随着参考基因组的扩展和使用新开发的质量评估工具（如ContScout），我们可以更好地评估获得的真核微生物基因组的质量。

真核生物的几个基因组结构特征，如外显子-内含子结构和缺乏保守的剪接标记，增加了在真核基因组注释中进行基因预测的难度。利用MetaEuk以及结合单细胞原虫转录组和富集的瘤胃转录组的数据库，我们筛选了来自大约一千个反刍动物GI宏基因组的contig。该分析识别出数百万个反刍动物真核蛋白质，进一步强调了瘤胃原虫的巨大代谢潜力，这与先前的研究一致。借助我们的蛋白数据库，我们通过重新分析牛和山羊瘤胃的蛋白质组数据来测试其资源应用性。我们大幅增加了识别到的真菌和原虫蛋白质组的数量。在GutEuk和衍生的蛋白质数据库的帮助下，我们能够更好地理解真菌和原虫在瘤胃中的独特代谢贡献。然而，蛋白质预测仍需要进一步的基因组修订，以将表达的蛋白质归因于特定物种。总之，新的工具GutEuk结合其相关数据库，能够对宏基因组中的GI真核生物进行全面分析。此外，通过EukDetect等工具增强了基于reads的肠道真核微生物生态分析，提供比基于标记的宏分类学方法更精细的分类学分辨率。总体而言，GutEuk及其相关数据库有助于深入了解反刍动物真菌和原虫在瘤胃生态系统中的功能贡献，以及它们与饮食和其他微生物的相互作用。

- 第一作者简介 -

加州大学伯克利分校

严鸣

博士后

严鸣，加州大学伯克利分校创新基因组研究所博士后，主要从事宏基因组学与生物信息学的研究。近两年以第一作者在Nature Communications, Microbiome, Genome Research等期刊上发表多篇论文，以共同第一作者在Science of the total environment发表论文一篇。

- 通讯作者简介 -

俄亥俄州立大学

于忠堂

博士生导师

于忠堂，美国俄亥俄州立大学教授、博士生导师。Microbiome、Journal of Dairy Science等杂志编辑。研究方向包括家畜肠道微生物与环境微生物生态学研究和生物质废弃物转化的微生物学基础研究等。在The ISME Journal、PNAS、Nature communications、和Microbiome等刊物发表文章200余篇，所发文章被引用超过22000次。